Tossicologia Cellulare - Farmacia & Salute

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APPROFONDIMENTI SCIENTIFICI > TOSSICOLOGIA

Meccanismi di degenerazione cellulare: come una sostanza ammazza le cellule di un organismo.
Tra Necrosi e Apoptosi esiste una differenza fondamentale: l’Apoptosi è un processo regolabile e modulabile; il termine “apoptosi” viene intercambiato per morte cellulare Programmata, ma le due cose non indicano la stessa cosa. L’Apoptosi è la morte cellulare fisiologica: durante lo sviluppo gli organi si formano prima andando incontro ad un processo di proliferazione e quindi incontro ad un processo di morte cellulare, che serve a determinare la forma finale di un organo.

Ci sono patologie umane in cui le cellule per un processo patologico muoiono per Apoptosi (Morbo di Parkinson, i neuroni degenerano nell’arco di anni).
Esistono patologie (Ictus Cerebrale) in cui la Necrosi e l’Apoptosi coesistono; nell’Ischemia, le cellule più vicine alla parte del Trombo muoiono subito per necrosi e sono irrecuperabili, mentre man mano che ci si allontana dal focus della lesione le cellule degenerano per apoptosi. Nelle patologie acute o croniche ci si prefigge il recupero delle cellule e quindi di prevenire l’apoptosi, mentre esistono patologie in cui si cerca di indurre l’Apoptosi (neoplasie).

Eventi biochimici:

  • La Necrosi: gruppi di cellule tutte vicine al punto in cui vi è stato l’evento traumatico; si può instaurare un quadro infiammatorio e le cellule lasciano andare il loro contenuto enzimatico che degrada le cellule.          Le cellule perdono l’impermeabilità, accumulano acqua rigonfiano e scoppiano.


  • Nell’Apoptosi, la cellula apoptotica non va incontro a lisi, si restringe, si raggrinza, ma non riversa il suo contenuto all’esterno, perché nel corso del processo di raggrinzimento la membrana plasmatica va incontro a formazione di estroflessioni (corpi apoptotici) che si staccano come vescicole.Tali estroflessioni contengono all’interno le parti delle cellule che vanno a degenerarsi.

I corpi apoptotici vengono fagocitati da macrofagi tessutali: la cellula viene frammentata e digerita senza riversare all’esterno i contenuti enzimatici dannosi (Morte Altruista!)

Durante lo sviluppo muoiono le cellule per dare la forma agli organi; muoiono per apoptosi le cellule infettate dai virus e quelle danneggiate per danno genomico, per evitare che alla progenie vengano ereditate caratteristiche anomale. Biochimicamente, le cellule che muoiono per apoptosi hanno gli organelli interni intatti al microscopio.
Nelle cellule apoptotiche ci si riferisce principalmente al grado di degradazione della Cromatina cellulare.
Nel processo di Necrosi vengono attivate le Nucleasi, che tagliano il DNA molto casualmente; nell’Apoptosi invece il processo di degradazione della cromatina avviene non casualmente, ma mediante un processo di condensazione e di degradazione che avviene mediante endonucleasi che tagliano la cromatina tra un Nucleosoma e un altro.


Gli acidi nucleici sono estraibili e poi si possono visualizzare su delle maglie di gel se sottoposti a campo elettroforetico. Nell’elettroforesi:

  • Gli acidi nucleici di cellule morte per apoptosi hanno l’aspetto di una scala a pioli (LADDERING).

  • Gli acidi nucleici di cellule morte per necrosi hanno l’aspetto di una striscia, in cui le bande sono multipli di 180 paia di basi (SHEAR)


Possono esserci anche quadri misti tra LADDERING E SHEAR: esiste un fenomeno che prevede condensazione e frammentazione della cromatina e che prevede un raggrinzimento della cellula, esistono degli enzimi che eseguono l’apoptosi e che hanno una specificità di substrato, in modo da discriminare un substrato da un altro.
Vi sono delle proteasi specifiche che vengono dette CASPASI (Cistenil-Aspartil-proteasi).
Sono delle famiglie di proteasi che nel loro sito attivo hanno sempre un residuo di Cys; nel substrato su cui agiscono, tagliano sempre dopo un residuo di acido aspartico e la specificità è determinata dai 3 amminoacidi che precedono il residuo di acido aspartico.



Le Caspasi influenzano il processo di degradazione della Cromatina; nell’apoptosi viene attivata la CAD, endonucleasi endogena; è mantenuta inattiva da una proteina che la ancora che si chiama I - CAD (I sta per inibitoria). Le Caspasi tagliano l’I-CAD lasciano libera la CAD, che farà il LADDERING.

I processi dell’Apoptosi sono :

  • ATTIVAZIONE

  • INTEGRAZIONE

  • ESECUZIONE

Nell’ATTIVAZIONE un segnale di morte arriva alla cellula: esso gli viene dall’ambiente extracellulare oppure dall’interno tutte le volte che vi è un danno genomico.
L’INTEGRAZIONE dei segnali è una fase in cui una cellula decide se sopravvivere o morire (si integrano i segnali di vita o di morte)
L’ESECUZIONE infine è la fase in cui la cellula decide di morire e inizia cosi l’Apoptosi.

ESECUZIONE.
Quando parliamo dell’esecuzione, entrano in gioco le CASPASI, famiglia di proteasi diverse tra di loro che si distinguono in:

  • CASPASI propriamente dette (Esecutive) : Caspasi-3, Caspasi-6, Caspasi-7

  • CASPASI: tutti gli altri numeri fino a 12 (oggi 14).


Queste Caspasi sono proteasi assimilabili a degli zimogeni e devono essere tagliate per poter essere attivate.
Strutturalmente hanno 3 domini:
2. NH terminale (detto Pro-dominio)
3. P20 (dominio di peso molecolare 20)
4. P10 (dominio di peso molecolare 10).



Le differenze tra i due tipi di Caspasi è nella lunghezza del pro-dominio, che è breve nelle Esecutive e lungo in tutte le altre. Le Esecutive subiscono un taglio tra il Pro-dominio e il p20 e quindi sono libere d’agire.

I pro-domini delle altre Caspasi prendono il nome di DED (Death Effect Domain, Caspasi 8,10,2) e CARD (Dominio di reclutamento attivatore Caspasi, tutte le altre escluse 3,6,7,8,10,2).  Quando si ha l’interazione CARD-CARD, si forma la Caspasi9.

Esistono degli inibitori delle Caspasi: si tratta di peptidimimetici in cui è presente un residuo di acido aspartico:

  • Z- VAD: sequenza di amminoacidi Valina ,Alanina ,D-Aspartato.

  • Y- VAD : “                   “                              “                            “

Gli inibitori delle Caspasi non risolvono nulla: le Caspasi intervengono nella fase finale, un inibitore impedisce la degradazione di una cellula che ormai ha smesso di funzionare.
Un effetto indesiderato è la potenziale comparsa delle Neoplasie.

FASE DI INTEGRAZIONE.
In tale fase vi è l’intervento dei geni della famiglia BCL-2: questo gene è stato originariamente trovato nel linfoma delle cellule
b .
Il Bcl-2 è un gene anti-apoptosi: è conservato nelle linee di sviluppo degli organismi; la sua famiglia si costruisce sulle analogie strutturali, ma non funzionali, in quanto sono presenti la funzione sia pro che anti- apoptotica.
Fanno parte della famiglia dei geni Bcl-2:

  • Bcl-2

  • Bcl-XL /Bcl-XS (S= short, proapoptosi;  L= long, antiapoptosi)

  • Bad (pro)

  • Bax

  • Bid

  • Bim

  • Bak


Strutturalmente sono composti aventi 4 domini BH (H sta per Homology), e cosa importante, anche se la struttura sembra diversa, contiene sempre un dominio BH3:



Vi è una cosa idrofobica che permette l’entrata nelle membrane (Bcl-2, Bcl-XL)

Nella famiglia, Bad e Bax mancano del gruppo BH4, ma permane la coda idrofobica, mentre Bid e Bim hanno solo il dominio BH3, ma non hanno la sequenza COOH terminale idrofobica.
Di tutti i domini BH, deve essere almeno presente il BH-3, che permette ai membri della stessa famiglia di interagire fisicamente l’uno con l’altro. Possono interagire tra loro due antiapoptotici o anche un pro-anti-apoptosi e un anti-apoptosi.
Altri fattori che vengono rilasciai dal mitocondrio sono l’AIF (fattore di induzione apoptosi), il quale è attualmente molto studiato: sembra essere una proteina pro-apoptosi in certe circostanze patologiche.
Altro fattore che viene rilasciato è il DIABLO (SMACK DIABLO) ed è una proteina pro-apoptosi, importante perché è vero che le Caspasi si trovano nel citoplasma in forma inattiva, però in qualche maniera la cellula deve garantire delle attivazioni casuali. Esistono delle proteine IAP che impediscono che le Caspasi vengano attivate casualmente (nelle distrofie muscolari che originano a livello del midollo spinale vi sono mutazioni alle IAP); il loro ruolo è quello di prevenire l’attivazione delle Caspasi, ma devono venire inattivate in caso di Apoptosi: la DIABLO inibisce le IAP e permette cosi l’attivazione delle Caspasi.

REGOLAZIONE BID, BIM, BAX

Ciò che regola i fattori pro-apoptosi è importante, poiché vi è qualcosa che limita tali fattori.
BID.
La forma attiva di Bid è il Bid troncato: a troncarlo è una Caspasi ed in particolare si parla di Caspasi con co-dominio DED, ovvero la 8.
Le Caspasi DED sono attivate da interazioni proteina-proteina: la 8 viene attivata in risposta all’attivazione di un recettore a monte. Esistono tali recettori, in quanto esistono momenti in cui l’apoptosi è necessaria: i recettori di morte sono tanti: uno tra questi è il FAS o CD-95, che si trova sui linfociti; questo è un recettore Transmembrana di tipo 1 ed ha un legando endogeno che è il FAS-L.  Quando viene attivato il FAS-L, viene attivato il FAS: questo ha una proteina adattatrice intracellulare (FADD) che ha un dominio DED: tale FADD interagisce con le altre proteine che abbiano un dominio DED (Caspasi 8).
Quando si attivano i recettori di morte, essi dimerizzano e trimerizzano e da ciò si può vedere che essi sono molto vicini tra di loro: ad esempio, ci sono molte Caspasi 8 che possono interagire tra loro.



“FLICE” (Caspasi 8) taglia il Bid e forma il Bid troncato.

Vediamo ora come viene tenuto inattivo il Bad.
Il Bad normalmente è tenuto inattivo in quanto è ancorato ad una proteina 14-3-3 ; tale proteina ha la funzione di trattenere Bad, il quale per essere reso inattivo deve subire la fosforilazione. Uno dei fattori di crescita è quello di tenere Bad in forma fosforilata, che aggancia alla proteina 14-3-3 ; nel momento in cui ci sono segnali di morte Bad si stacca e funziona e viene defosforilato.
Attraverso una proteina AKT viene fosforilato il Bad su un residuo di Serina-128; la fosforilazione su siti diversi da parte di chinasi attivate da stress.
Allo stesso modo funziona Bim, un fattore pro-apoptosi senza dominio COOH terminale.
Bim viene ancorato alle proteine del citoscheletro dalla Dineina; nel momento in cui esso deve funzionare, si sgancia: vi è un aumento di ioni Ca2+ che attivano proteasi che degradano la Dineina. Bax è un gene strettamente controllato a livello trascrizionale e viene trascritto quando necessario.

A questo punto dobbiamo parlare di una proteina che ha come gene bersaglio BAX (fattore di trascrizione), ovvero il
P53, che codifica per un fattore pro-apoptosi che uccide le cellule dove necessario.  P53 è detto “sensore del danno del DNA cellulare” ed è una proteina che segnala gli eventi e danni del genoma di una cellula e in base al danno dà una risposta di riparazione o di tipo apoptotico se il danno è troppo esteso.
Avrà anche la funzione di arrestare il ciclo cellulare per riparare il danno o qualora questo sia irreparabile di indurre l’apoptosi.
Tale proteina ha un dominio centrale DBD (Domain Binding DNA) che consente al gene di andare a legarsi alle sequenze dei geni da trascrivere; ha un dominio NH terminale di transattivazione, un dominio COOH terminale che è ripiegato in maniera tale da impedire di legare il promotore dei geni in determinate condizioni.




Sul COOH terminale vi sono residui di Lys.
L’Ubiquidina è un proteina che serve come segnale di degradazione: riduce nelle cellule i contenuti di p-53; per stabilizzare vi è l’acetilazione sui residui di Lys.
Il dominio COOH consente al p53 di essere degradato o stabilizzato da segnali di diacetilazione; tale proteina porta a processi di dimerizzazione e tetramerizzazione.
La Funzione del dominio NH: tale dominio di transattivazione è un dominio in cui i segnali convergono per attivare il p-53: funziona quindi da sensore.
Il danno viene segnalato mediante fosforilazione sul dominio di transattivazione e la specificità è in grado di dire a p-53 se il danno è leggero o se è massimo.


Vi sono chinasi che operano la fosforilazione in alcuni siti: PI-3-Kinasi (fosfatidil-inositolo) fosforilano su residui di SER 15 e 36.
Tra queste chinasi sono 2 le più conosciute: ATM [mutata in atassia (incoordinazione motoria dovuta a degenerazione cerebellare) e teleangetassia (Dilatazione vasale)] e DNA- PK
Tali chinasi vengono attivate da un taglio di eliche di DNA; di solito nel momento in cui il danno si manifesta queste chinasi vengono attivate in quanto agganciate alle estremità dei tagli.
In altri casi vengono fosforilati residui diversi: in caso di danno grave viene fosforilata la SERINA 46;  in questo caso è il target di una proteina attivata dallo stress (JUN - KINASI) fosforila il p53 dando un segnale di danno genomico: essa fosforila il JUN o meglio il C- JUN, geni di precoce inducibilità o secondi messaggeri.

Esistono geni nelle cellule indotti nell’arco di 30’; questi geni si comportano da fattori di trascrizione per altri geni, sono diversi e funzionano come omodimeri.
Il JUN agisce da fattore di trascrizione, per essere fosforilato occorre una chinasi, la JUN – chinasi che viene attivata in risposta allo stress: in questo caso fosforila il p53 sulla Serina-46 e l’attiva.
La JUN CHINASI nei casi in cui è inattiva, è fisiologicamente legata al dominio di transattivazione di p53.
Sul dominio di transattivazione forma un legame con una proteina, l’ MDM-2 , importante perché nel caso in cui è presente e legata al p53, essa impedisce la fosforilazione sul dominio di transattivazione.
La MDM-2 ci comporta da Ubiquidina Ligasi: essa lega i residui di Ubiquidina ai residui di Serina e cosi facilita la degradazione di P53.
P53 funziona da fattore di trascrizione, in quanto ha una serie di geni da trascrivere; il tipo specifico di gene dipende dall’entità del danno cellulare.
Se l’entità di danno è bassa, induce geni di arresto e riparazione del danno cellulare, altrimenti geni di apoptosi.
In caso di danno il gene è il p21 (arresta il ciclo); con la riparazione viene trascritto GADD 45; se la cellula va incontro ad apoptosi viene trascritto il BAX e l’ MDM-2.



CICLO CELLULARE.
  


Ci sono cellule Perenni che si trovano in una fase G0 (neuroni).
Ci sono molecole che guidano la transizione tra le fasi: sono le CHINASI che per essere attivate hanno bisogno di un attivatore, la CICLINA e pertanto vengono dette CDK ( chinasi ciclino-dipendenti)
Considero una cellula dell’epitelio intestinale che riceve il segnale di proliferazione: la cellula è il fase G1, una fase preparatoria alla fase S; viene prodotta la Ciclina D, di cui ne esistono 3 tipi (D1, D2, D3) anche se la più trascritta è la D1.
Le CDK attivate dalle Cicline della famiglia D sono le 4 e le 6 (CDK-4 e CDK-6).

Le CDK devono fosforilare una proteina, la Retinoblastoma (RB), tumore dell’occhio che colpisce i bambini quando il RB è mutato.
Il RB si comporta come una proteina a tasca: esso lega a se un fattore di trascrizione E2-F vincolandolo.
Prima della fosforilazione il RB è attivo e vincola tale fattore E2-F , quando viene fosforilato si ha inattivazione si sgancia (siamo ancora in G1).
L’E2-F sganciandosi fa trascrivere i geni che codificano per proteine importanti per la transizione alla fase S: viene in particolare indotta una Ciclina, la E che come partner ha la CDK-2.
La funzione di questo nuovo complesso è quella di fosforilare sempre il RB, la cui fosforilazione porta alla trascrizione di altri geni, in particolare di un’altra Ciclina (A) e proteine per la sintesi del DNA (DNA polimerasi
a ; Antigene per proliferazione cellulare nucleare).

CICLINA A è più prossima alla fase S: ha anch’essa bisogno di una CDK per funzionare, in particolare della CDK 2 nuovamente, ma anche della CDK-1 : ciò significa che queste due cicline condividono lo stesso CDK.
La CICLINA E è transitoria, in quanto viene indotta e subito dopo degradata; è più lontana dalla fase S e la sua CDK 2 funzionerà insieme alla Ciclina A che intanto sarà stata sintetizzata.

Dopo la Fase S vi è la fase G2 di preparazione alla mitosi; tale fase è affidata al complesso Ciclina B1- CDK1.
La Ciclina A viene degradata dopo la fase S e quando arriva alla fase G2 ci sarà la B1 che utilizzerà la CDK-1.
Tra le sue funzioni quella di partecipare alla frammentazione della membrana cellulare; ci sono delle modalità con cui la cellula controlla il susseguirsi degli eventi; alcune cicline devono essere degradate.
Per essere attivate, le CDK prevedono la fosforilazione su un residuo di Treonina, mentre quando non servono più, devono essere inattivate mediante fosforilazione su residui di Tyr.


Esistono dei CHECK POINT (punti di controllo) del ciclo cellulare, punti ben definiti del ciclo nelle transizioni: essi arrestano il ciclo perché si è in presenza di un danno.
In questo caso entrano in funzione delle proteine particolari, le CDK –I (inibitorie), che comprendono almeno 2 famiglie:

  • INK : Fanno parte di questa famiglia le proteine P15, P16, P18, P19

  • CIP/KIP: Fanno parte di questa famiglia le proteine P21 (gene bersaglio di P53, arresta il ciclo), P27 e P57.


P16 viene trascritto da un gene che può avere due griglie di lettura alternative; codifica anche la proteina P14 ARF che trattiene nel nucleolo la proteina TD-DM2 che degrada P53.
Esistono delle neoplasie in cui ad essere mutato è il p16: c’è un caso degli individui con melanomi di tipo familiare che derivano dal P16 mutato.

Differenze tra INC e CIP/KIP.
Gli INC sono inibitori del complesso CICLINA D/CDK 4-6 e gli eventi della fase G1;
I CIP/KIP sono inibitori di tutte le fasi del ciclo cellulare G1 -->S/ S / G2 --> M: bloccano tutto.

P21 è un gene che indotto arresta tutte le fasi del ciclo cellulare; I CIP/KIP inibiscono complessi Ciclina/CDK già formati, mentre gli INC inibiscono la formazione del complesso.
P21 è il gene bersaglio di p53; dal punto di vista delle neoplasie p21 non è frequentemente mutata per i tumori.
Gli animali Knock-out per p21 presentano iperplasie agli organi, però non sviluppano Neoplasie: l’animale ha tutti gli organi più grandi del normale, ma non ha tumore.

P21 viene considerata una proteina d’arresto, ma gli eventi apoptotici che seguono sono indipendenti da essa; P53 si serve di P21 solo per arrestare i cicli cellulari.
Mutazioni ai geni p21 e p27 portano ad iperplasie, mentre per mutazione di p57 si hanno tumori.
Un tumore tipico è quello di WILM ‘S che colpisce i bambini ed è attaccato ai reni: è bilaterale.
P18 è in regioni di cromosomi riarrangiati in donne che sviluppano cancro al seno.  

P53 tramite P21 arresta il ciclo in qualunque fase, però si può avere arresto in fase G2 anche indipendentemente da p53, in quanto si può avere una diversa modalità di arresto.
In questo caso le CDK vengono inattivate dalla fosforilazione sulla TYR; siamo in fase G2  M e abbiamo un complesso Ciclina B1- CDK1 ; la mitosi per avvenire, occorre che CDK-1 sia attiva.
Ma essa è inibita dalla fosforilazione sulla Tyr: occorre quindi de fosforilare la Tyr, il che equivale ad una attivazione del CDK.
La Defosforilazione è eseguita dalle Fosfatasi e in questo caso si ha la Fosfatasi CDC 25 C (la Fosfatasi non è uguale per tutti i complessi, ogni complesso ha la sua fosfatasi).

Ammettiamo che c’è un danno genomico e occorre arrestare le cellule indipendentemente da p53; non devo consentire al complesso di funzionare e quindi occorre inibire la CDC-25C e per inibirla la devo fosforilare con una chinasi che si chiama CHK-I, che fosforila la fosfatasi impedendo la sua azione fosforilante sulla Tyr e avendo cosi il blocco.

Di base lo scopo della terapia antineoplastica è indurre un processo apoptotico in cellule che si svincolano dal sistema di controllo.
Gli antineoplastici oggi in uso inducono danno al DNA ed attivano quindi i sistemi di controllo che finora abbiamo visto, inducono quindi apoptosi.
Però esistono molti tumori che possono sfuggire se hanno sistemi di controllo mutati : ad esempio se abbiamo p53 mutato, esso non può essere sensore del danno.

Esistono delle altre possibilità come l’utilizzo di dosi di antineoplastico tali da uccidere le cellule neoplastiche in ogni caso, ma gli effetti sono devastanti.
L’uso di farmaci antineoplastici diversi invece di uno che danneggia il DNA: posso avere farmaci che inibiscono la proliferazione delle cellule mediante inibitori delle CDK.
Questi inibitori sono dei Flavonoidi e di base entrano in terapia per i tumori metastatizzati.
Un inibitore attualmente in uso è FLAVOPIRIDOLO che inibisce le CDK 4-6 in modo preferenziale.


Piuttosto che attivare un Check Point occorre spegnerlo; ammetto di avere una cellula con un DNA danneggiato in fase S; abbiamo utilizzato un farmaco; avremo cellule con un DNA danneggiato che arriveranno in fase G2--> M; ammettendo che il p53 è mutato, esiste un Check Point in G2-->M indipendente da p53 (CHK -I)
Le cellule che hanno superato la Mitosi moriranno alla fase G1 successiva, perché saranno Aploidi.


 
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